1、GSE34526的GSEA

使用GSEA對(duì)GSE34526進(jìn)行KEGG分析，以探究PCOS患者和對(duì)照組中所有基因表達(dá)數(shù)據(jù)的通路分布。結(jié)果顯示溶酶體在NES=2.04的PCOS組中顯著富集（圖1a），提示其可能在PCOS的病理生理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2、GSE34526中的DEG鑒定

GSE34526數(shù)據(jù)的差異分析發(fā)現(xiàn)3003個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），其中2192個(gè)上調(diào)，811個(gè)下調(diào)。對(duì)這些差異基因進(jìn)行聚類分析，如火山圖所示（圖1b）。隨后，利用維恩圖，得到188個(gè)LRDEG（溶酶體相關(guān)差異表達(dá)基因）（圖1c）。

3、功能富集分析

LRDEGs的KEGG富集結(jié)果顯示，這些基因在哮喘中富集倍數(shù)最多，在吞噬體中的富集程度最高，且在多個(gè)免疫相關(guān)方面均有富集，此外，這些基因在鐵死亡途徑中富集，提示溶酶體作用可能與PCOS患者的鐵死亡有關(guān)。GO富集分析包括三個(gè)部分：生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。在BP方面，LRDEGs主要參與與MHCII類蛋白復(fù)合物的肽抗原組裝、通過(guò)MHCII類蛋白加工和呈遞外源肽抗原，以及參與免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的免疫球蛋白產(chǎn)生。而在CC方面，MHCII類蛋白復(fù)合物的富集倍數(shù)最高，溶酶體和溶酶體膜的富集程度最高。在MF方面，LRDEG明顯富含MHCII類受體活性和MHCII類蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合（圖ef）。

4、FRDEGs

由于富集分析表明LRDEG在鐵死亡途徑中富集，作者從FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)下載了鐵死亡基因，并將DEG與它們進(jìn)行交叉，進(jìn)一步鑒定出41個(gè)重疊的FRDEG（鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因）（圖2a）。KEGG對(duì)FRDEGs的富集分析顯示，這些基因在流體切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路中顯著富集，此外，在自噬通路中富集最為豐富，在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化自噬通路中富集程度更高（圖2c-d）。

5、PPI網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步探究FRDEGs的作用，作者將其上傳至STRING軟件，構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3a）。隨后利用Cytoscape插件（MCC）對(duì)FRDEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SRC、JUN、ALB、STAT3、KRAS、ZEB1、HMOX1、ATG7、ATM和HMGB1為top10的關(guān)鍵基因，處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心位置。其中，SRC為top1基因，可能是PCOS患者鐵死亡發(fā)生的必需蛋白（圖3b）。

6、SRC的單基因GSEA通路分析

基于以上結(jié)果，作者將研究重點(diǎn)放在SRC上。在之前的KEGG和GO富集分析中，作者發(fā)現(xiàn)SRC參與了流體切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路，以及脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化。此外，SRC在細(xì)胞凋亡過(guò)程和溶酶體中也發(fā)揮了正向調(diào)控作用。

為了探索SRC的潛在功能，作者進(jìn)行了單基因GSEA-KEGG通路分析。SRC可能參與花生四烯酸代謝（NES=1.84）和溶酶體（NES=1.24），這進(jìn)一步提示SRC對(duì)PCOS患者溶酶體功能的影響（圖3c-d）。

7、3組SRC表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，作者利用大鼠實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠卵巢組織中的SRC進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，測(cè)定了不同組小鼠卵巢中SRC的表達(dá)水平（圖3e），結(jié)果顯示高雄激素血癥組小鼠的SRC平均值較高，與對(duì)照組（P=0.004）和高脂血癥組（P=0.002）相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3f）。

8、3組受胎率及產(chǎn)仔數(shù)比較

結(jié)果表明，高脂飼料喂養(yǎng)的雌性大鼠受胎率（4/9）低于對(duì)照組（6/9），但高于高雄激素血癥組（2/9）；高雄激素血癥組的產(chǎn)仔數(shù)（7/2）和受胎率均顯著低于其他兩組（40/4和65/6）（圖4）。但可能由于樣本量較小，各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。